Notch 信號通路在銀屑病發病中的作用機制研究方法

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其主要病理特征為角質形成細胞過度增殖，導致表皮可凋亡的角質形成細胞異常分化，并伴隨皮膚炎癥浸潤及血管生成異常等。銀屑病病程較長、易復發且較難治愈。目前關于銀屑病的發病原因和機制尚無定論，但普遍認為與遺傳和環境相關Notch 信號通路由多種分子及蛋白組成，參與多種疾病的發生過程，與銀屑病的發生密切相關。目前研究較多的是 Notch?信號通路與免疫介導機制在銀屑病發病中的作用 。角質形成細胞是構成表皮結構的主要細胞，約占表皮細胞總數的 80%?。多種皮膚腫瘤及炎癥性皮膚病的發生與角質形成細胞增殖、凋亡、分化異常相關 。HaCaT?細胞是從成人皮膚中分離的永生化角質形成細胞系，其遺傳特性穩定，增殖、分化特性與角質形成細胞相似，在進行實驗研究時常用來替代角質形成細胞。2014 年 4月 ～ 2015 年 6 月，本研究觀察 Notch 信號通路關鍵因子在銀屑病皮損區皮膚中的表達情況及對 HaCaT

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細胞增殖、凋亡及分化的影響，探討 Notch?信號通路在銀屑病發病中的作用機制。

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材料與方法

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1． 1 皮膚組織標本來源 選擇同期山東省中醫院就診的斑塊型銀屑病患者 30?例( 病例組) ，均經皮膚組織病理檢查確診。其中男 18?例、女 12?例，年齡18 ～ 75( 32． 6 ± 7． 4) 歲。采集患者皮損區皮膚組織為病例組，同時采集距皮損區 1 cm?非皮損區皮膚組織作為對照組。納入標準: 皮損區近 2?周未外涂藥物，近 1?個月未接受免疫抑制劑及其他藥物治療。排除標準: 年齡 ＜?18?歲或 ＞?75?歲; 合并皮膚腫瘤或其他增生性皮膚病; 有心腦血管、肝、腎及造血系統等嚴重原發性疾病或其他情況不適合取材者。同期選取本院皮膚科留存的健康人皮膚組織樣本 30?例作為正常組，健康人男 16 例、女 14 例，年齡 18 ～ 69

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( 34． 2 ± 6． 8) 歲。三組性別、年齡比較差異無統計學意義( P 均 ＞ 0． 05) 。三組去除皮下結締組織與皮下脂肪后，于液氮中速凍，－ 80 冰箱中保存備用。

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1． 2細胞、試劑及儀器人永生化角質形成細胞系 HaCaT，購于中國科學院細胞庫。Notch 信號通路特異性激活劑( Jagged1-Fc 融合蛋白) 和 Notch 信號通路特異性阻斷劑( DAPT) ，購于美國 Ｒ＆D System 公司; TＲIzol、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑 ( SYBＲ Green I) ，購于日本 TaKaＲa 公司; Notch1、Jagged1、B淋巴細胞瘤 / 白血病-2 ( Bcl-2 ) 、Bcl-2 相關 X 蛋白 ( Bax) 、角蛋白 1 ( Keratin1) 和重組人外皮蛋白( In-volucrin) 單克隆抗體，購于美國 Abcam 公司; 辣根過氧化物標記的二抗，購于北京中杉金橋生物技術有限公司; DMEM 培養基、100 μg / mL 碘化丙啶( PI) 、Annexin-V-FITC，購于美國 Sigma 公司; MTT 試劑盒購于普洛麥格北京生物技術有限公司; BCA 蛋白定量試劑盒、5 × SDS 蛋白上樣緩沖液，購于天根生化科技有限公司; FBS，購于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2 培養箱，購于常州菲普實驗儀器廠; 倒置顯微鏡，購于日本尼康; ＲT-PCＲ 儀，購于瑞士Ｒoche 公司; 流式細胞儀，購于美國 BD 公司; Multi-skan MK3 型酶標儀，購于芬蘭 Thermo Labsys2tems公司。

1． 3細胞培養及處理從液氮罐中取出裝有HaCaT 細胞的凍存管，放入 37恒溫水浴鍋中快速解凍，待細胞凍存液融解后，將細胞移至 5 mL 無菌離心管中，加入含有 10% FBS 的 DMEM 培養液

3 mL稀釋凍存液中的 DMSO，1 000 r / min 離心

5 min，去除上清液。加入新的培養液吹打重懸細胞沉淀，接種到細胞培養皿中，置于 37 ，5% CO2 培養箱中培養。細胞貼壁后換液 1 次，去除漂浮的死細胞，之后定期換液，待細胞融合度達 80% 以上時，用0． 25% 的胰酶消化并收集細胞，按 1 3 的比例進行傳代培養。取對數生長期的 HaCaT 細胞，去除細胞培養液，用 PBS 清洗細胞 2 次，用 0． 25% 的胰酶消化，待細胞呈單個存在時終止消化，離心收集細胞沉淀。用培養液重懸、計數后，將細胞濃度調整為 5 × 104 / mL，每孔 200 μL 接種于經紫外照射滅菌的96 孔培養板中，置于 37、5% CO2 ?培養箱中培養24 h后，去除細胞培養液，將細胞隨機分為 Jagged1-Fc 融合蛋白組、DAPT 組、常規對照組，分別加入含 ( 終濃度 0、0． 5、1、2 μg / mL) Jagged1-Fc 融合蛋白、 ( 終濃度 0、5、10、20 μmol / L) DAPT、常規細胞培養液進行培養。

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1． 4皮膚組織中 Notch1、Jagged1 mＲNA 表達檢測

用ＲT-PCＲ 技術。取三組皮膚組織，用 TＲIzol 法提取總ＲNA。紫外分光光度計檢測總 ＲNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總 ＲNA 質量; 用 PrimeScriptTM ＲTＲeagent kit 逆轉錄試劑盒合成將 ＲNA 逆轉錄成cDNA，用 ＲT-PCＲ 試劑盒檢測。根據 GenBank 數據庫中公布的人 Notch1 和 Jagged1 mＲNA 序列，用Primer5． 0 軟件設計 ＲT-PCＲ 引物，送上海派森諾生物科技有限公司合成，引物序列為 Notch1-F: 5'-GT-CAACGCCGTAGATGACCT-3'，Notch1-Ｒ: 5'-CAGGTT-GTACTCGTCCAGCA-3';Jagged1-F: ?5'-GTCCCACTG-GTTTCTCTGGA-3'，Jagged1-Ｒ: ?5'-CCACAGACGTTG-GAGGAAAT-3'; ?β-actin-F: 5'-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3'，β-actin-Ｒ: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3'。ＲT-PCＲ 擴增條件: 預變性 95 5 min，變性 95 30 s，退火 60 30 s，延伸 72 30 s，35 個循環。用 β-actin?作為內參，采用 2?－?Ct?法計算目的基因相對表達量。

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1． 5皮膚組織中 Notch1、Jagged1 蛋白及 HaCaT 細胞內 Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin 蛋白表達檢測采用 Western blotting 法。取三組皮膚組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取皮膚組織總蛋白; HaCaT細胞 經 Jagged1-Fc?融 合 蛋 白、DAPT?處 理。用0． 25% 的胰酶消化、收集細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取 HaCaT?細胞總蛋白。按照試劑盒說明書測定組織及細胞總蛋白濃度。蛋白上清液稀釋至統一濃度后，與 Loading buffer?按體積 4 1?混勻，100煮沸 5 min?使蛋白變性。將變性蛋白樣品加入SDS 蛋白凝膠上樣孔中，每孔 50 μL，常規方法垂直電泳。電泳結束取出蛋白凝膠，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙的順序在 4轉膜過夜。PBST洗滌 3 次，PVDF 膜用 5% 脫脂奶粉封閉 2 h，然后依次與一抗( 500 倍稀釋) 、二抗( 1 000 倍稀釋) 孵育，滴加 ECL 顯色液，在暗室中曝光，用 Odyssey 成像系統掃描各條帶灰度值，β-actin 條帶作為內參照。目的蛋白相對表達量 = 目的蛋白灰度值 / β-actin 灰度值。

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1． 6HaCaT 細胞增殖活力檢測采用 MTT 法。

HaCaT 細胞經 Jagged1-Fc 融合蛋白、DAPT 處理，置于 37 、5% CO2 培養箱中培養 24、48、72 h，每孔加入 0． 5% 的 MTT 溶液 20 μL，繼續培養 4 h，棄去培養液，加入 DMSO 150 μL，低速振蕩 10 min 溶解藍紫色結晶。用空白調零孔調零，用酶標儀測定波長 570 nm 處光密度 ( A) 值，A 值與細胞數量呈正比，以 A 值作為評價細胞增殖活力的指標。

1． 7HaCaT 細胞凋亡率檢測采用流式細胞術。

取對數生長期的 HaCaT?細胞分別用終濃度為 2?μg /mL 的 Jagged1-Fc 融合蛋白、終濃度為 20 μmol / L DAPT 處理 72 h，棄去細胞培養液，PBS 清洗細胞 2次，加入 0． 25% 的胰蛋白酶消化、收集細胞，以不做處理的細胞作對照。細胞計數，用細胞培養液重懸細胞，調整細胞為 1 × 106 / mL。取細胞懸液 1 mL 加入 1． 5 mL 離心管中，4，1 200 r / min，離心 5 min，棄上清液。向細胞沉淀中加入 Binding Buffer 200μL，充分混勻后分別加入 PI 5 μL 和 Annexin V-FITC 5 μL，避光室溫孵育 20 ～ 30 min，加入 Binding Buffer 400 μL，用流式細胞儀檢測 HaCaT 細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

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1． 8統計學方法采用 SPSS21． 0 統計軟件。計量資料用 x珋± s 表示，比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。P ＜ 0． 05 為差異有統計學意義。